Tips For Solving Problems In Immunohistochemistry (Ihc)

The immunohistochemistry (IHC) is a technique commonly applied in the field of both research and clinical diagnosis. The use of antibodies on a section of tissue allows the specific proteins of interest to be detected, to later determine both their location and abundance by microscopy.

Although, in principle, the protocol may seem relatively simple to apply, it requires optimizing some parameters that will be essential for the good resolution of each test. The same protocol can work perfectly with one antibody, but not with others; and some antibodies may need specific adjustments in some of the steps of the procedure.

In this entry we collect some key considerations to optimize the results and solve problems in Immunohistochemistry (IHC) .

How To Troubleshoot Immunohistochemistry (Ihc)

Below we detail the possible causes (PC) that can lead to ambiguous or erroneous results, as well as the tips or solutions (S) to solve them:

1.- Absence Of Stain

– Antigens –

PC: Absence of antigen, or presence in very low quantity

  • S1: Analyze protein expression by in situ hybridization.
  • S2: Include an amplification step of the detection signal in the protocol.
  • S3: Increase the concentration of the antibody.

PC: Alteration of epitopes during the fixation step

  • S: Try to restore immunoreactivity using antigen recovery techniques.

PC: Ineffective antigen recovery

  • S1: Increase the treatment time.
  • S2: Change the recovery technique.

PC: The protein is located in the nucleus and the antibody cannot penetrate

  • S: Add permeabilizing agents to the blocking buffer and to the antibody dilution buffer.

– Antibodies –

PC: Antibodies have lost activity

  • S1: Follow manufacturer’s instructions regarding antibody storage criteria. (You can find some tips for properly storing antibodies in this post .)
  • S2: Always include positive controls to rule out antibody malfunction.

PC: Incompatibility between primary and secondary antibody

  • S: The secondary antibody must be directed against the species in which the primary antibody was generated. ( Here you can consult a Guide to select secondary antibodies .)

PC: Incorrect primary antibody

  • S: Select a specific antibody against the antigen of interest. It should be borne in mind that in immunohistochemistry, the antibody must recognize the native conformation of the antigen, so it is worth contrasting in the technical sheet that has been validated for use in this application.

– Sample preparation –

PC: Inadequate tissue fixation

  • S1: Increase the fixing time.
  • S2: Try a different fixer.

PC: Over-fixation of the tissue

  • S: Reduce the duration of the dive or the post-fixation steps.

– Reagents –

PC: Reagents have been added in an incorrect order and / or steps have been omitted

  • S: Carefully review the procedure that has been carried out.

2.- Weak Stain Of Protein Diana

– Antigens –

PC: Inadequate antigen recovery

  • S1: Vary the recovery conditions.
  • S2: Change the recovery method

PC: Alteration of the electrostatic charge of the antigen

  • S: Adjust the pH or cationic concentration of the antibody buffer.

– Antibodies –

PC: Low reactivity of the primary antibody

  • S1: Ensure that the pH of the antibody diluent is within the optimal range specified for antibody binding (pH 7-8).
  • S2: Make sure that the antibody has been stored according to the manufacturer’s instructions.
  • S3: Increase the concentration of the primary antibody and / or the incubation time.

PC: Inhibition of secondary antibody

  • S1: Reduce the concentration of the secondary antibody. (While high concentrations of secondary antibody may increase background staining, extremely high concentrations may have the opposite effect, reducing antigen detection.)
  • S2: If the diluent contains antibodies that neutralize the antigen, these will block the binding of the secondary antibody. Remove neutralizing antibodies or change diluent.

– Sample preparation –

PC: Improper fixing method

  • S1: Increase the fixing time.
  • S2: Try a different fixing method.

– Reagents –

PC: enzyme – substrate reactivity

  • S1: Change the enzyme diluent.
  • S2: Prepare the substrate again at a suitable pH.

3.- High Background Noise

– Antibodies –

PC: Secondary antibody exhibits cross reactivity or nonspecific binding

  • S1: Treat the tissue with normal serum of the species that the secondary antibody.
  • S2: Use pre-adsorbed antibody against the species of the sample.

PC: Non-specificity of the primary antibody

  • S1: Reduce the concentration of the primary antibody
  • S2: Increase the concentration of the blocking buffer and reduce the time between blocking and the addition of the primary antibody.
  • S3: Use a different primary antibody.

PC: High concentration of primary or secondary antibody

  • S: Titrate the antibody to determine the optimal working concentration.

PC: Hydrophobic interactions between the antibody and other proteins present in the tissue

  • S: Reduce the ionic strength of the antibody diluent.

PC: incubation time or temperature too high

  • S: Reduce the incubation time and / or temperature.

PC: Inadequate washing of sections

  • S: Wash at least three times between each of the steps of the procedure.

– Sample preparation –

PC: Presence in the tissue of endogenous enzymes (peroxidases and / or phosphatases)

  • S1: Block peroxidases with hydrogen peroxide in methanol before incubation with the primary antibody.
  • S2: Inhibit the action of endogenous phosphatases with levamisole.

PC: Presence of endogenous biotin

  • S: Block endogenous biotin activity by avidin / biotin blocking reagent before incubation with the primary antibody.

PC: The fabric sections have dried

  • S: Prevent the tissue from drying out during the staining process.

The Immunohistochemistry (IHC) technique, like other immunoassays, involves various steps that cannot be universally optimized, having to adjust certain conditions for each of the assays, which translates into a multitude of variables that can affect the the results are as expected.

Une percée technique pour la préparation d’échantillons de protéines

La préparation des échantillons est généralement la première étape de presque tous les travaux sur les protéines. La qualité d’une telle préparation est essentielle à la réussite de l’analyse des protéines. La qualité de l’échantillon de protéines dicte la qualité des résultats expérimentaux. Il existe une demande croissante de préparations protéiques de petite qualité et à grande échelle à des fins analytiques. Comme l’analyse des protéines est devenue de plus en plus complexe, la demande de techniques de préparation d’échantillons adéquates a également augmenté. La préparation d’échantillons de protéines est de plus en plus critique pour les personnes qui travaillent sur la protéomique, la génomique fonctionnelle, les études cliniques, l’expression différentielle, le trafic de protéines et les études structurales et fonctionnelles des protéines. Les préparations d’échantillons de protéines les plus couramment utilisées comprennent, mais sans s’y limiter, l’extraction totale des protéines des cellules ou des tissus en culture, l’isolement / purification des protéines de la membrane plasmique et les fractionnements cellulaires. Traditionnellement, la préparation des échantillons de protéines est réalisée par une variété de techniques dites à base de solutions. Une ou plusieurs solutions de lyse cellulaire couplées à une centrifugeuse représentent un format majeur de méthodes d’extraction de protéines basées sur des solutions. Un exemple typique de préparation d’échantillons de protéines à base de solution utilise le tampon RIPA pour l’extraction totale des protéines. Cette méthode extrait les protéines des échantillons à l’aide d’un tampon d’extraction relativement doux. La procédure dure environ 20 à 30 minutes. Ces dernières années, une technologie basée sur une colonne de rotation est apparue comme une alternative pour l’extraction basée sur une solution. Cette technologie de nouvelle génération associe les méthodes traditionnelles à une colonne de centrifugation spécialement conçue pour une extraction rapide et efficace des protéines. La protéine totale peut être extraite des cellules ou des tissus cultivés en aussi peu que 1 min avec un rendement élevé en protéines et un profil protéique complet sans aucun biais. Par rapport aux méthodes traditionnelles, la technologie basée sur les colonnes tournantes représente une percée technologique et rivalisera favorablement avec les méthodes traditionnelles en termes de facilité d’utilisation, de vitesse et de performances. Cette nouvelle technologie a le potentiel de remplacer le tampon RIPA pour les préparations d’échantillons de protéines.

Basé sur une colonne de spin par rapport à une solution

RIPASonication Spin-Column Based
Temps de traitement (min)25-6015-251-5
Taille d’échantillon minimale (ul)5020020
Ligne de base endogèneNon Oui / Non Oui
Profil protéique complet NonOui / Non Oui
Concentration finale Moyenne Moyenne Élevée
Répétabilité Mauvais Bon Excellent
Facilité d’utilisation Passable Médiocre Excellent